Introducción

La familia Orchidaceae es característicamente cosmopolita, existen excepciones en su distribución como la Antártida, con especial preferencia en zonas tropicales de todo el mundo. Las especies se distribuyen en unos 1000 géneros con 25 a 30000 especies (Rivero & Chirino, 2015). En Ecuador la familia Orchidaceae se mantiene como la familia que aporta con el mayor número de especies al fitoendemismo del Ecuador (1707 spp.), pues aproximadamente un tercio de las plantas endémicas son orquídeas (León-Yánez et al., 2011), Endara et al. (2009) sostienen que en el Ecuador continental existen 1710 especies de orquídeas endémicas representadas por 6583 especímenes de herbario, la diversidad en función de la gradiente altitudinal en continente indica que la mayor cantidad de orquídeas endémicas se distribuye entre 1500 a 2500 msnm.

A nivel nacional las orquídeas representan un importante rubro económico, sea en calidad de producto ornamental o como un atractivo turístico. Por ejemplo, en la provincia de Manabí, en el litoral ecuatoriano, se han identificado 66 especies de orquídeas, pertenecientes a 39 géneros distintos, con potencialidad para su aprovechamiento en actividades turísticas por su belleza (Sánchez & Rodríguez, 2018). Las orquídeas juegan también un papel importante en el equilibrio ecosistémico en los diferentes microclimas ecuatorianos, especialmente en la Cordillera de los Andes, y del mundo en donde ellas se distribuyen.

Las exportaciones de Orquídeas, incluidos sus esquejes enraizados son grandes y constantes en términos de ingresos por exportación, y del 2016 al 2019 sus principales destinos fueron Estados Unidos, Alemania y Singapur (Gallardo et al., 2021).

Por estas razones, las estrategias para la conservación de orquídeas en un país megadiverso como el Ecuador son un reto, sea por su importancia económica o por sus servicios ecosistémicos. El cultivo in vitro es una técnica que ha permitido la propagación de distintas especies de orquídeas, pero el lento crecimiento de este grupo de plantas, así como el costo de las sales minerales y del agente gelificante (agar) empleados en los medios de cultivo, pueden limitar su aplicación (Flores-Hernández et al., 2017).

Tradicionalmente se ha creído que la simbiosis de las orquídeas con diferentes géneros de hongos es crucial para su propagación, sin embargo, se ha demostrado que no es así, las semillas de orquídeas pueden crecer sobre medios diferentes, dependiendo de las especies, todos los medios de cultivo deberán contener un carbohidrato como fuente de carbono y energía, minerales y agar, otros contienen vitaminas, amino ácidos, reguladores de crecimiento o extracto de plantas como la pulpa de banano o extracto de papa. Se pueden cultivar tanto las semillas como los brotes vegetativos, en el primer caso el cultivo in vitro permite obtener una tasa mayor de éxito en la germinación gracias a que el medio suple la ausencia de endospermo, la semilla no se limita a la interacción fungi-planta, permite germinar embriones inmaduros, acorta el tiempo de espera y obtiene plantas sanas (Perea, 2009; Pierik, 1990).

Objetivos

• Preparar medio Murashige y Skoog (MS) modificado a su cuarta parte de concentración enriquecido con endospermo líquido de coco y extracto de pulpa de banano (sustancias de composición no definida) para el cultivo in vitro de orquídeas.
• Cultivar asimbióticamente in vitro semillas de orquídeas no identificadas en medio MS modificado.

Materiales y métodos

Materiales y reactivos

• ± 4 cápsulas de semillas de orquídeas.
• Soluciones stock
• Agar
• Sacarosa
• ±250 ml de endospermo líquido de coco.
• 50 a100 g de homogenizado de banano (pulpa).
• Soluciones NaOH y HCl 0.1 M
• Agua destilada
• Alcohol al 70 %
• Cajas Petri
• Papel Film o rollopack
• Pipetas
• Probetas
• Mortero
• Erlenmeyer o bolón aforado a 1000 ml
• Varilla de agitación
• Pinzas
• Bisturí
• Servilletas esterilizadas
• Mechero
• Autoclave
• Potenciómetro
• Balanza
• Agitador magnético
• Cámara de flujo laminar
• Incubadora
• Rotulador

Metodología

El experimento se realizó en ellaboratorio de Biotecnología Vegetal de la Facultad de Ciencias Agrícolas, Universidad Central del Ecuador.

Procedimiento:

1. Elaboración previa de los cálculos (masas y volúmenes). El medio modificado MS, requiere colocar el ¼ de volúmenes de las soluciones stock sin considerar la solución de componentes orgánicos, esta será sustituida por los elementos de composición no establecida.
   • Macronutrientes: 25 ml.
   • Micronutrientes: 2.5 ml.
   • Sulfato de Hierro/EDTA: 2.5 ml.
   • Orgánicos: sustituido por ±250 ml de endospermo líquido de coco (agua de coco y de 50 a 100 g de pulpa homogenizada de banano.
   • Sacarosa: concentración al 3 % →30 g.
   • Agar: 8 % →7.5 g.
2. Preparar las soluciones stock, diluir en 250 ml de agua destilada (evitando su precipitación).
3. Colocar cada solución stock cambiando las puntas de las micropipetas para evitar contaminaciones.
4. Pesar los sólidos.
5. Aforar con agua destilada hasta los 500 ml.
6. Agitar hasta homogenizar la solución en el agitador magnético.
7. Agregar 250 ml de agua de coco y 50 g de pulpa de banano.
8. Volver agitar y homogenizar.
9. Aforar a 1000 ml con agua destilada.
10. Determinar el pH, se estimó un pH de partida de 5.022 y se detuvo la corrección en un pH de 5.806 con las soluciones de HCl y NaOH 0.1 M.
11. Agregar el agar y la sacarosa, homogenizar.
12. Calentar hasta homogenizar totalmente el medio empleando un microondas.
13. Trasvasar a un frasco Boeco con tapa con capacidad necesaria.
14. Autoclavar a 121 °C, 15 psi por al menos 20 minutos.
15. Enfriar y trasvasar a las cajas Petri.
16. Colocar hasta 1 cm de altura de medio MS modificado en 40 cajas Petri en una cámara de flujo laminar. Siguiendo protocolos se asepsia.
17. Sellar las cajas con rollopack.
18. Colocar las cajas apiladas en un frigorífico para que solidifiquen y estén listas para la siembra.

Cultivo de Semillas

1. Lavar con agua jabonosa la superficie de las cápsulas de orquídeas y luego secarlas con papel estéril.
2. En una cámara de flujo laminar, rociar alcohol al 70 % sobre la cápsula y luego flamear, repetir el procedimiento tres veces.
3. Realizar una incisión limpia en los polos de la cápsula y cortar con un bisturí uno de sus lóbulos para liberar las semillas.
4. Con la ayuda de una pinza y el bisturí esparcir las semillas sobre la superficie del medio MS modificado de forma homogénea, siguiendo todos los protocolos de asepsia.
5. Homogenizar, flamear los bordes y la tapa, tapar y sellar con rollopack.
6. Rotular y colocar en la incubadora.
7. Esperar la germinación de las semillas, el tiempo puede variar en función del género de orquídeas.

Resultados

Se preparó 1 litro de medio de cultivo Murashige y Skoog (MS) modificado el cual se distribuyó en 40 cajas Petri para el cultivo asimbiótico de semillas de orquídeas de género y especie desconocida. El medio se preparó con la cuarta parte de micro y macro nutrientes, cuarta parte de hierro y sin stock de compuestos orgánicos de composición y concentración conocida, ésta se sustituyó por elementos de composición y concentración desconocida, se añadió 250 ml de endospermo líquido de coco y con 50 g de homogenizado de pulpa de banano.

Se realizó la siembra de las semillas de la cápsula de orquídea seleccionada y previamente esterilizada en el medio de cultivo MS modificado, obtuvo un cultivo homogéneo de semillas color crema, pequeñas, alargadas, delgadas y apuntadas en ambos extremos como se observa en la figura 1.

Discusión

Las cápsulas empleadas para la obtención de las semillas se encontraban en madurez fisiológica, no dehiscentes y sin fisuras. No se realizaron pruebas de germinación ni viabilidad previas, no se observó en estereomicroscopio la existencia de embrión como lo sugieren Pérez-Martínez & Castañeda-Garzón (2016). Un factor que determinará el éxito de la germinación es el estado de madurez de las cápsulas, en general, las semillas de una cápsula verde, permanecen en estado de latencia, en el cual no se logra alcanzar una etapa mínima de desarrollo y por lo tanto se restringe la germinación (Pérez-Martínez & Castañeda-Garzón, 2016). Por otro lado, la desinfección de las semillas, específicamente la desinfección de las cápsulas de las orquídeas resulta un paso muy importante para lograr obtener cultivos axénicos con una tasa mayor de germinación, los investigadores Billard et al. (2014) concluyeron que la concentración de 0.5 % de hipoclorito de sodio no afectó la germinación in vitro de las especies estudiadas del género Oncidium hasta los 48 días después de sembrados. Concentraciones mayores disminuyen la germinación y la realización de tres enjuagues con agua estéril, en la etapa de desinfección de las semillas, favorece un mayor porcentaje de supervivencia de los protocormos.

El medio de cultivo para un embrión inmaduro, exige condiciones especiales diferentes a las que contienen otros medios de cultivo para la germinación asimbiótica (Pedroza-Manrique & Bejarano-Tibocha, 2008). La germinación de semillas de orquídeas cultivadas in vitro a partir de cápsulas, varía dependiendo de su madurez, de la calidad de las semillas y del tipo de orquídea, sin embargo, los informes de diferentes autores mencionan que en promedio germinan después de 30 y 60 días de cultivo (Pérez-Martínez & Castañeda-Garzón, 2016), no todas las orquídeas requieren de reguladores de crecimiento parala germinación, ya que generalmente los embriones contienen concentraciones endógenas de hormonas para iniciar su desarrollo (Pierik, 1990).

Las propiedades fisicoquímicas del medio determinarán también el éxito en la germinación de las semillas de orquídeas, el potencial osmótico de los medios de cultivo pueden alterarse en función de la composición del mismo por lo que los elementos de composición variable y no conocida pueden afectar este parámetro, para medio MS, el potencial osmótico es menos negativo conforme se reducen la concentración de sales, esto puede dificultar la disponibilidad de los macro y micro nutrientes del medio de cultivo (Andrade-Rodríguez et al., 2015), la concentración de sales para este medio de cultivo fue reducido a la cuarta parte, tanto para macro como para micro nutrientes, por lo que el potencial osmótico del medio dependerá de la concentración de sales del endospermo líquido de coco así como del homogenizado de banano.

Los investigadores Kaur & Bhutani (2012) concluyeron que el uso de homogenizado de banano (BH) en una medida de 50 g l^-1 de medio, favorece la tasa de regeneración, formación de brotes, brotes vigorosos y de raíces de Cymbidium pendulum. Estos resultados son los que se esperan con la modificación de medio MS enriquecido con BH, a fin de que la formación de protocormos se vea estimulado de forma efectiva. Andrade-Rodríguez et al. (2015) mencionan que el primer indicio de éxito en la germinación en las semillas de orquídeas es el cambio de color de amarillo-crema a verde que determina el inicio de formación de los protocormos.

El medio MS modificado a la mitad de concentración (50 %) o a la cuarta parte (25 %), encuentran diferencias en la formación de plántulas según mencionan Andrade-Rodríguez et al. (2015) el medio MS al 50 % obtuvo un 4 % de plántulas de Cattleya sp., sin embargo, las semillas que germinaron en el medio MS al 25 % de concentración de sales generaron plántulas de color verde amarillento, indicando deficiencia nutrimental por la baja concentración de macro y micro nutrientes, en estos  medios no se colocaron elementos adicionales como agua de coco o BH, estos dos elementos de composición variable y desconocida pueden limitar en función de sus componentes la germinación de las semillas, finalmente los autores determinaron que el sulfato ferroso y el EDTA de sodio son componentes del medio de cultivo necesarios para la germinación de semillas de la orquídea estudiada. En el caso del cultivo in vitro de semillas de Oncidium stramineum según Flores-Escobar et al. (2008) obtienen una mejor respuesta cuando el medio MS es suplementado con 30 g.l^-1 de sacarosa y 6.5 g.l^-1 de agar, 100 ml.l^-1 de agua de coco, 40 g.l^-1 de extractos de manzana, plátano y jitomate, 2.0 g.l^-1 de peptona y 200 mg.l^-1 de polivinil pirrolidona (PVP), estos valores se acercan o coinciden con los volúmenes y pesos manejados en este ensayo con los elementos de medio coincidentes, a este respecto se han explorado otros suplementos como es el caso del jugo de piña que ha obtenido resultados positivos en la geminación asimbiótica y formación de plántulas de las orquídeas Prosthechea vespa y Sobralia klotzscheana por encima del suplemento de endospermo liquido de coco, ambos en medio MS (Salazar & Cancino, 2012).

Conclusiones

Se obtuvo un cultivo asimbiótico in vitro de semillas de orquídeas extraídas de cápsulas fisiológicamente maduras de genero y especie no identificada. El medio de cultivo Murashige y Skoog (MS) modificado se preparó a un cuarto de concentración (25 %) sin considerar el stock de componentes orgánicos que sugiere su fórmula original, se sustituyó por 250 ml de endospermo líquido de coco y 50 g de homogenizado de banano, con 7.5 g de agar, 30 g de sacarosa y pH de 5.806.

Recomendaciones

Se recomienda la realización de pruebas de germinación previas de las semillas a emplear, así como pruebas de viabilidad como la constatación de embriones mediante observación a través de estereomicroscopio. 

Se sugiere replicar el ensayo con elementos o sustancias de concentración y composición desconocida diferentes a los empleados en este ensayo a fin de determinar diferencias en la germinación de las semillas.

Referencias

Andrade-Rodríguez, M., Vargas-Araujo, J., Villegas-Torres, O., López-Martínez, V., Guillen-Sánchez, D., & Alia-Tejacal, I. (2015). Germinación de semillas y crecimiento de plántulas de Cattleya (Brassolaeliocattleya) in vitro. Interciencia, 40(8), 549–553.

Billard, C. E., Dalzotto, C. A., & Lallana, V. H. (2014). Desinfección y siembra asimbiótica de semillas de dos especies y una variedad de orquídeas del género Oncidium. Polibotánica, 38, 145–157.

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Gallardo, M., Trujillo, G., Jaramillo, R., & Rodríguez, J. (2021). Ecuador genera propuesta para el fortalecimiento de la cadena de valor de orquídeas en la región amazónica (Napo, Morona Santiago y Zamora Chinchipe). Serie Artículos Técnicos OTCA, 7, 1–12. https://trade.cites.org/

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