Preparación del Medio de Cultivo MS (Murashige & Skoog)

Introducción Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos y/o tejidos animales o vegetales. La diversidad metabólica de estos es tan grande que la variedad de medios de cultivo es enorme, no existiendo un medio de cultivo…

Alejandro Aguirre Flores

25 de septiembre de 2024

Introducción

Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos y/o tejidos animales o vegetales. La diversidad metabólica de estos es tan grande que la variedad de medios de cultivo es enorme, no existiendo un medio de cultivo universal adecuado para todos ellos (C. Rodríguez & Zhurbenko, 2018).

El cultivo in vitro es una técnica que se utiliza en diversos campos de la biología para mantener organismos vivos, o partes de estos, bajo condiciones controladas dentro de un laboratorio. Si bien las áreas más desarrolladas de esta técnica son la microbiología y la biología celular de líneas celulares animales, el cultivo de tejidos vegetales también ha mantenido un desarrollo constante en las últimas décadas, y es aplicado en la conservación de plantas ornamentales como las orquídeas endémicas de la selva, la restauración de bosques, la generación de plantas modificadas para producir nutrientes esenciales, o la producción de fármacos, entre otros (Perea, 2009; UTEC, 2019).

Para el cultivo de células, embriones, tejidos vegetales es necesario emplear un medio adecuado con las mínimas condiciones nutricionales para dichas unidades vitales, de entre la gran diversidad de medios de cultivo in vitro utilizados habitualmente, el medio Murashige y Skoog (MS) es el medio más conocido (Tetsumura et al., 2008). El Medio Murashige & Skoog (MS), o MS0, fue inventado por los científicos Toshio Murashige y Folke K. Skoog en 1962 durante sus investigaciones de nuevos reguladores del desarrollo vegetal y se ha convertido en el medio más comúnmente usado en el cultivo in vitro de tejidos vegetales. Como investigador doctoral de Skoog, Murashige originalmente estaba enfocado en encontrar la hormona del crecimiento presente en el jugo del tabaco, sin tener éxito. En su lugar, el análisis del jugo de tabaco revelo altas concentraciones de minerales específicos. Una serie de experimentos posteriores demostró que variando los niveles de estos nutrientes promovía el crecimiento sustancialmente, en comparación con formulaciones existentes. Se determinó que el nitrógeno, en particular, promovía el crecimiento del tejido de tabaco en cultivo. El número después de las letras MS, sirve para indicar la concentración de sucrosa en el medio, por ejemplo, MS0 no contiene sucrosa, mientras que el MS20 contiene 20 g/L de sucrosa. Esta formulación del medio Murashige & Skoog (MS) no contiene fuente de carbono (sucrosa), hormonas vegetales (auxinas y citocininas) o vitaminas. Aprobado para su uso en el cultivo de tejidos vegetales. Concentración de trabajo recomendada: 4.3 g/L (PROBIOTEK, 2021). Para la elaboración del medio de cultivo se determina el volumen necesario de cada solución stock para alcanzar la concentración final requerida y de acuerdo al volumen a preparar. Para ello se usa la fórmula (1) descrita en (Agar et al., 1996; Casado et al., 2012; C. Rodríguez & Zhurbenko, 2018):

C1 x V1 = C2 x V2 (1)

Donde:

C1, concentración de la solución stock

V1, volumen requerido de la solución stock para alcanzar la concentración adecuada en el medio de cultivo.

C2, Concentración requerida en el medio de cultivo

V2, Volumen de medio de cultivo a preparar.

Objetivos

Elaborar 500 ml de medio de cultivo Murashige & Skoog (MS) enriquecido con ácido Naftalenacético.
Comprender la importancia de preparar soluciones stock para facilitar la preparación de distintos medios de cultivo.
Conocer la composición básica que requiere un medio de cultivo.

Materiales y métodos

Materiales y reactivos:

Agua destilada
Soluciones stock de micronutrientes, macronutrientes, solución de hierro.
Solución ANA (ácido naftalenacético) (auxinas)
Sucrosa
Agar
Soluciones de OHNa y HCl 0.1 M
Pipetas
Micropipetas
Vasos de precipitación de plástico con capacidad de 500 ml.
Probetas
Balones volumétricos aforados a 500 ml
Potenciómetro
Agitador eléctrico
Microondas
Succionador de mano o pera de succión
Papel aluminio
Frascos de vidrio con capacidad de 250 ml
Rotuladores
Autoclave
Equipo de protección personal (EPP)

Tabla 1. Tabla de concentraciones de medio MS.

Esquema de preparación del medio

Resultados

Se elaboró 500 ml de medio de cultivo MS simple y 500 ml de medio de cultivo MS enriquecido con auxinas de tipo ácido naftalenacético (ANA) (1 ml/500ml de medio) siguiendo las recomendaciones descritas en la metodología.

Los cálculos teóricos siguiendo las concentraciones dadas en la tabla estándar fueron los siguientes:

1 ppm= 1mg/L

1 g= 1000 mg

V2: 4500ml

C1.V1 = C2.V2

STOCK I. (NH4NO3)

C1x V1=C2 x V2

C1: 82500 mg/L V1: X

C2: 1650 mg/L V2: 500 ml

82500 mg/L x V1= 1650 mg/L x 500 ml

V1= 1650 mg/l x 500 ml / 82500 mg/l

V1= 10 ml de solución stock I

STOCK II. (MgSO4. 7H2O)

C1x V1=C2 x V2

C1: 37000 mg/L V1: X

C2: 370 mg/L V2: 500 ml

37000 mg/L x V1= 370 mg/L x 500 ml

V1= 370 mg/l x 500 ml / 37000 mg/l

V1= 5 ml de solución stock II

STOCK III. (CaCl2. 2H2O)

C1x V1=C2 x V2

C1: 44000 mg/L V1: X

C2: 440 mg/L V2: 500 ml

44000 mg/L x V1= 440 mg/L x 500 ml

V1= 440 mg/l x 500 ml / 44000 mg/l

V1= 5 ml de solución stock III

STOCK IV. (KH2PO4)

C1x V1=C2 x V2

C1: 17000 mg/L V1: X

C2: 170 mg/L V2: 500 ml

17000 mg/L x V1= 170 mg/L x 500 ml

V1= 170 mg/l x 500 ml / 17000 mg/l

V1= 5 ml de solución stock IV

STOCK V. (FeSO4. 7H2O)

C1x V1=C2 x V2

C1: 2780 mg/L V1: X

C2: 27.8 mg/L V2: 500 ml

2780 mg/L x V1= 27.8 mg/L x 500 ml

V1= 27.8 mg/l x 500 ml / 2780 mg/l

V1= 5 ml de solución stock V

STOCK VITAMINAS (Tiamina-HCl B1)

C1: 100 ppm = 100 mg/L V1: X

C2: 0.1 mg/L V2: 500 ml

100 mg/L x V1= 0.1 mg/L x 500 ml

V1= 0.1 mg/l x 500 ml / 100 mg/l

V1= 0.5 ml de Tiamina

STOCK VITAMINAS (Ácido Nicotínico B3)

C1: 100 ppm = 100 mg/L V1: X

C2: 0.5 mg/L V2: 500 ml

100 mg/L x V1= 0.5mg/L x 500 ml

V1= 0.5 mg/l x 500 ml / 100 mg/l

V1= 2.5 ml de Ácido Nicotínico B3

STOCK VITAMINAS (Piridoxina-HCl B6)

C1: 100 ppm = 100 mg/L V1: X

C2: 0.5 mg/L V2: 500 ml

100 mg/L x V1= 0.5mg/L x 500 ml

V1= 0.5 mg/l x 500 ml / 100 mg/l

V1= 2.5 ml de Piridoxina-HCl B6

STOCK AMINOÁCIDO (Glicina)

C1: 100 ppm = 100 mg/L V1: X

C2: 2.0 mg/L V2: 500 ml

100 mg/L x V1= 2.0mg/L x 500 ml

V1= 2.0 mg/l x 500 ml / 100 mg/l

V1= 10 ml de glicina

STOCK AMINOÁCIDO (myo-Inositol)

C1: 10000 ppm = 100 mg/L V1: X

C2: 100mg/L V2: 500 ml

10000 mg/L x V1= 100mg/L x 500 ml

V1= 100 mg/l x 500 ml / 10000 mg/l

V1= 5 ml de myo-Inositol

SUCROSA (30 g/l)

30g————–1000ml

X—————-500ml

X= 30g x 500ml/1000ml X=15g

AGAR (8 g/l)

8g————–1000ml

X————–500ml

X= 8g x 500ml/1000ml X=4g

Discusión

Los cultivos vegetales in vitro aportan en la investigación una gran cantidad de herramientas y técnicas que permiten fortalecer múltiples estudios referentes a temáticas relacionadas con el campo agrícola, la salud, la biología, y la genética, entre otras. Los cultivos vegetales aportan al conocimiento de la morfología y comportamiento bioquímico que presentan las plantas y la utilidad que estos compuestos pueden llegar a tener a nivel farmacológico y médico, tomando, en las últimas décadas, un rol importante como nueva manera de investigación en tratamientos contra varias enfermedades (Alcántara et al., 2017).

El cultivo de las especies vegetales in vitro debe mantenerse altamente desinfectado y libre de agentes patógenos, en lo posible, las condiciones tienen que ser óptimas para evitar que los cultivos puedan contaminarse, por lo que regularmente debe realizarse una desinfección minuciosa dentro del laboratorio (Alcántara et al., 2017).

El medio MS, no es el más recomendado para todos los cultivos, tan solo representa un medio estándar y no sustituye medios con concentraciones específicas para determinadas especies vegetales o sus tejidos (Rodríguez et al., 2004).

Conclusiones

Se elaboró 500 ml de medio de cultivo MS simple y 500 ml con auxinas (ácido naftalenacético) según la metodología.

Para la preparación de medios de cultivo se requiere el cálculo previo de los volúmenes a tomar de cada solución stock, lo que requiere alta precisión para no exceder las concentraciones recomendadas por el fabricante y con ello crear las mejores condiciones para el cultivo de células vegetales, embriones u explantos que se requiere.

Recomendaciones

Es muy importante cumplir con los tiempos específicos de esterilización en el autoclave a fin de mantener los medios completamente libres de la incidencia de patógenos.

Es importante mantener la asepsia en todo momento en el laboratorio. Especialmente durante el manejo de los medios, se recomienda etiquetar todas las soluciones y medios para la posterior identificación y utilización.

Referencias

Agar, B. C. A. F., Sabouraud, C. A. F., & el Rosa Bengala, C. A. F. (1996). Comparación entre los diversos medios de cultivo comerciales para aislamiento de hongos (levaduras y mohos). Técnicas de LABORATORIO, 275(211).

Alcántara, J., Castilla, M., & Sánchez, R. (2017). Importancia de los cultivos vegetales Invitro para establecer bancos de germoplasma y su uso en investigación. Biociencias, 1, 71–83.

Casado, C., Torrico, G., & Medina, M. (2012). Medios de cultivo en un laboratorio de microbiología. Laboratorio Files WordPress.

Perea, M. (2009). Cultivo de Tejidos Vegetales In Vitro (Universidad Nacional de Colombia | Sede Bogotá | Facultad de Ciencias, Ed.; 3ra ed., Vol. 1). Proceditor Ltda. http://ciencias.bogota.unal.edu.co/fileadmin/Facultad_de_Ciencias/Publicaciones/Imagenes/Portadas_Libros/Biologia/Cultivo_de_Tejidos_Vegetales_In_Vitro/Cultivo_de_Tejidos_Vegetales_In_Vitro.pdf?fbclid=IwAR2xLhdtU-7yKztpAvuWQjdZYh-ltzpcYT6PnzpAErkw__ZozfqclxwYy-Y

PROBIOTEK. (2021). Murashige & Skoog (MS) Medium – Probiotek. Medio de Cultivo MS. https://www.probiotek.com/productos/reactivos/medios-de-cultivo-reactivos/murashige-and-skoog-ms-medium/

Rodríguez, A., Rodríguez, A., Quintero, S., Torres, M., & Fundora, Z. (2004). Influencia de los medios de cultivo en la micropropagación de plátano (Musa spp.) y malanga (Xanthosoma sagittifolium Schott). Cultivos Tropicales, 25(1), 23–26. http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=193230179004

Rodríguez, C., & Zhurbenko, R. (2018). Manual de Medios de Cultivo (4ta ed., Vol. 1). BioCen. www.biocen.cu

Tetsumura, T., Matsumoto, Y., Sato, M., Honsho, C., Yamashita, K., Komatsu, H., Sugimoto, Y., & Kunitake, H. (2008). Evaluation of basal media for micropropagation of four highbush blueberry cultivars. Scientia Horticulturae, 119(1), 72–74. https://doi.org/10.1016/J.SCIENTA.2008.06.028

UTEC. (2019, March 30). Cultivo “in vitro” de tejidos vegetales | Blog de Bioingeniería | Universidad de Ingeniería UTEC. Universidad de Ingeniería y Tecnología. https://www.utec.edu.pe/blog-de-carreras/bioingenieria/cultivo-vitro-de-tejidos-vegetales