Aguirre-Flores, Alejandro Alfredo¹

¹Facultad de Ciencias Agrícolas, Universidad Central del Ecuador. Ciudadela Universitaria, 170521, Quito, Pichincha, Ecuador. aaaguirre@uce.edu.ec; https://orcid.org/0000-0002-2759-4377; https://www.researchgate.net/profile/Alejandro-Aguirre-Flores; https://scholar.google.es/citations?user=b_9-OU0AAAAJ&hl=es

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Introducción

Los ácidos nucleicos, en especia el ADN, son macromoléculas fundamentales en la continuidad de la vida. El ADN contiene la información hereditaria que se transmite de generación en generación y proporciona la información necesaria para el ensamblaje de proteínas necesarias para construir y mantener el funcionamiento celular (Karp, 2011).

El ADN está formado por componentes químicos básicos denominados nucleótidos. Estos componentes básicos incluyen un grupo fosfato, un grupo de azúcar y una de cuatro tipos de bases nitrogenadas alternativas. Para formar una hebra de ADN, los nucleótidos se unen formando cadenas, alternando con los grupos de fosfato y azúcar. Los cuatro tipos de bases nitrogenadas encontradas en los nucleótidos son: Adenina (A), Timina (T), Guanina (G) y Citosina (C). El orden, o secuencia, de estas bases determina qué instrucciones biológicas están contenidas en una hebra de ADN (Auffray & Tapie, 2004).

La obtención ácido desoxirribonucleico purificado es un punto clave para el desarrollo de técnicas moleculares que permiten caracterizar una especie en estudio. Las matrices vegetales constituyen una de las muestras de mayor complejidad debido a los compuestos químicos que la forman y que muchas veces difieren su concentración en dependencia de la variedad en estudio (Suazo et al., 2020).

Actualmente existen diversos métodos de asilamiento de ADN desarrollados por la ciencia, se han creado kits de extracción que promulgan remover la mayoría de los compuestos inhibitorios del tejido vegetal más eficientemente que los métodos “caseros o empíricos” de aislamiento, la evidencia experimental en la literatura continúa encontrando resultados no satisfactorios en las extracciones de ADN de matrices recalcitrantes como sucede con cultivares como café (Coffea arabica) o cacao (Theobroma cacao) o con características bioquímicas muy específicas (alto contenido de polisacáridos y polifenoles, entre otros) como con algunos frutos como pitahaya (Hylocereus undatus), comprometiendo su calidad e incluso su aplicación a distintos análisis moleculares. Es debido a esta importancia que el protocolo de purificación es un criterio fundamental que debe ser considerado para los objetivos y el alcance de una investigación.

Es por esto que el ensayo de protocolos de extracción y purificación de ADN, resulta trascendental para la comprensión de la estructura y características físico-químicas de esta macromolécula. En este informe de laboratorio se describe el protocolo de extracción de ADN de plántulas de tomate de árbol (Solanum betaceum) cultivadas in vitro en el Laboratorio de Biotecnología Vegetal de la Facultad de Ciencias Agrícolas de la Universidad Central del Ecuador.

Objetivos

• Obtener ADN de buena calidad a partir de hojas de tomate de árbol generadas en medio in vitro.
• Discutir a la luz de la literatura los protocolos de extracción de ADN.
• Obtener ADN de tejidos vegetales de hojas de plántulas de tomate de árbol generadas en medio in vitro.

Materiales y métodos

Materiales y reactivos

• Buffer de extracción CTAB 2X
• Cloroformo : alcohol isoamílico (24:1)
• Etanol 70 % frío (glaciar)
• Isopropanol frío (glaciar)
• β-mercaptoetanol
• Hojas de tomate de árbol crecidas en medio in vitro (2 aprox. ≈ 200 mg)
• Tubos eppendorf de 1.5 ml
• Mortero y pistilo
• Micropipetas de 1 a 20; 10 a 100 & 100 a 1000 ul de volumen
• Baño térmico (María)
• Papel toalla
• Rotulador

Metodología

Sitio Experimental: Laboratorio de Biotecnología Vegetal de la Facultad de Ciencias Agrícolas, Universidad Central del Ecuador.

Procedimiento:

1. Tomar 1 a 2 hojas jóvenes de tomate de árbol.
2. Colocar las hojas en un mortero.
3.  Agregar de 800 ul de buffer de extracción (2X CTAB).
4. Triturar las hojas lo más finamente y homogéneamente con el pistilo.
5. Transferir el extracto desde el mortero a un tubo eppendorf de 1.5 ml.
6. Incubar el tubo en baño térmico o baño María a 62 °C por 45 minutos. (Se colocó por 20 minutos).
7. Agregar 400 ml de mezcla de cloroformo: alcohol isoamílico (24:1) y agitar vigorosamente hasta que adquiera un aspecto lechoso.
8. Dejar reposar el tubo por 5 minutos sobre la mesa.
9. Centrifugar a 13000 rpm por 10 minutos.
10. Colectar el sobrenadante con una micropipeta, sin tocar la interfase blanquecina y transferido a un tubo eppendorf limpio.
11. Agregar un volumen de isopropanol frío e invertir el tubo eppendorf varias veces hasta observar una especie de hilos que se condensan (ADN).
12. Transferir el ADN al otro tubo usando una punta de micropipeta de boca ancha. (si no se condensó el ADN, centrifugar por 1 minuto a 12000 rpm).
13. Lavar el ADN con etanol al 75 %. Eliminar el exceso de etanol y dejar secar por 5 a 10 minutos.
14. Resuspender al ADN con 50 ul de TE y guardarlo en refrigeración o congelación.

Extracción de ADN de una muestra vegetal: Kiwi (Actinidia deliciosa) 🥝

Resultados

Se obtuvo una porción blanquecina en el tubo eppendorf con apariencia de hilos o filamentos como se muestra en la Figura 1. Este precipitado es, según detalla el procedimiento, el ADN recuperado de dos hojas de tomate de árbol cultivado in vitro.

Discusión

La extracción de ADN con material cotidiano es una propuesta práctica que permite desarrollar una estrategia didáctica interdisciplinar puesto que extraer ADN de un organismo, en este caso una planta in vitro, implica relacionar conceptos explicados por varias disciplinas científicas, permite poner en práctica conceptos básicos de Química, Física y Biología mostrando la naturaleza interdisciplinar de la ciencia, al tiempo que constituye una oportunidad para transmitir de manera transversal el conocimiento científico, desde los fundamentos científicos que constituyen el proceso hasta los recientes desarrollos biotecnológicos, su impacto social y sus implicaciones éticas (Marcos-Merino et al., 2019).

En la práctica de laboratorio se realizó la extracción de ADN. Inicialmente se rompe la pared celular y la membrana plasmática por medio de la fase de licuación y agregación de 800 ul de tampón de lisis (CETAB), para poder acceder al núcleo de esta. Por consiguiente, se rompe la membrana nuclear para la obtención del ADN. En la disolución de lisis, la sal común se encuentra en una concentración saturante (en exceso respecto al disolvente), lo que aumenta la fuerza iónica: debilita las interacciones iónicas entre biomoléculas (como entre el ADN y las proteínas asociadas a él) y aumenta las interacciones hidrofóbicas entre proteínas, provocando su coagulación, en la interfase etanol-agua, las moléculas de alcohol se unen a las de agua, desplazando así el agua que interacciona con el ADN y la que interacciona con los iones de Na⁺, haciendo posible su disolución. Este desplazamiento permite que algunos iones Na⁺ se unan a los iones fosfato del ADN, neutralizando su carga, perdiendo su solubilidad y facilitando la precipitación del ADN como filamentos blanquecinos, este color es debido a la red cristalina que forma con el NaCl (Cohn, 1925; Marcos-Merino et al., 2019).

Las soluciones buffer empleadas normalmente en la extracción de ADN, están compuestas de bicarbonato sódico, en las células, es muy importante mantener el pH dentro de un intervalo para preservar la estabilidad y funcionalidad de sus biomoléculas, el bicarbonato de sodio actúa manteniendo el pH constante (pH=6.5 aprox.), éste evita la degradación del ADN. El intervalo de pH que regula un amortiguador depende de su cantidad, por las reacciones de desprotonación que se generan durante la lisis celular, por eso se añade a la disolución de lisis bicarbonato sódico en exceso (Bustamante et al., 2011).

La formación de una red cristalina de sal y ADN, y su consiguiente precipitación, es un proceso exotérmico. El calor liberado hace que aumente ligeramente la temperatura, lo que resulta en una disminución de la solubilidad del oxígeno del agua y en la formación de burbujas. Estas burbujas se observan junto a los filamentos blancos en los que precipitan la sal y el ADN (en la zona en la que se produce la reacción exotérmica), haciendo que los filamentos de ADN floten (Bustamante et al., 2011). Por otro lado, existen sustancias inhibitorias en la extracción del ADN, la co-extracción de polisacáridos y polifenoles actúan como inhibidores durante la extracción del ADN, y que, en dependencia de su concentración, pueden llegar a oxidar el ADN durante el proceso de lisis (Suazo et al., 2020), polisacáridos y compuestos polifenólicos frecuentemente precipitan y contaminan los ácidos nucleicos durante la extracción, lo que afecta tanto la calidad como la cantidad de ácidos nucleicos aislados, donde el método CETAB, es el que mejor resultado tiene en cuanto a inhibidores, en esto además la edad fisiológica de los tejidos es fundamental por lo que la acumulación de hidratos de carbono es menor en tejidos jóvenes, por una menor tasa fotosintética que tejidos adultos que ya han acumulado gran variedad de azúcares y otros metabolitos que pueden contaminar el ADN a extraer, lo propio con el órgano, normalmente las frutas poseen mayor cantidad de inhibidores en su mayoría carbohidratos (Betancurt-Olvera et al., 2018).

Conclusiones

Se extrajo ADN de los tejidos foliares de una plántula de tomate de árbol (Solanum betaceum) cultivado in vitro siguiendo la metodología CETAB, las características físicas del precipitado son las de un precipitado blanquecino de estructura fibrilar.

Recomendaciones

La extracción de ADN se facilita en tejidos jóvenes, por lo que es recomendable realizar la extracción siempre de plántulas jóvenes, libres de contaminantes biológicos.

Lara la identificación de azúcares se sugiere realizar pruebas mediante el reactivo de bial, cuyo viraje a verde indica presencia de ribosas (pentosas). Para la identificación de grupos fosfato, se sugiere la prueba específica mediante la reacción de la muestra con ácido molíbdico y ascórbico que presenta un viraje de color a azul que es característico para la demostración de la existencia de estos grupos en la muestra.

Referencias

Auffray, C., & Tapie, E. (2004). El genoma humano: una explicación para comprender, un ensayo para reflexionar (1a ed.). Siglo XXI Editores.

Betancurt-Olvera, M., Pérez-Lainez, M. D., Nieto-Angel, R., Barrientos-Priego, A. F., García-Mateos, M. D. R., & Corona-Torres, T. (2018). Comparación de seis métodos de extracción de ADN en Tejocote (Crataegus mexicana Moc. & Sessé). Revista Fitotecnia Mexicana, 41(1), 75–79. https://doi.org/10.35196/RFM.2018.1.75-79

Bustamante, J., Astudillo, M., Pazos, J., & Bravo, L. (2011). Evaluation of Two Methods DNA Extraction from Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissues on Non-Optimal Conditions. Acta Biológica Colombiana, 16(2), 83–97.

Cohn, E. J. (1925). The physical chemestry of the proteins. Physiological Reviews, 5(3), 349–437. https://doi.org/10.1152/PHYSREV.1925.5.3.349

Karp, G. (2011). Biologia celular y molecular: conceptos y experimentos (6ª). McGraw Hill México. https://books.google.com.mx/books?hl=es&lr=&id=Wa6HBwAAQBAJ&oi=fnd&pg=PA1&dq=membrana+celular+vegetal&ots=koKmg1SDm8&sig=GqLZkxso28mha8f9X8mUvzFw-uQ#v=snippet&q=funciones de la membrana&f=false

Marcos-Merino, J., Gallego, R., & Gómez, J. (2019). Extracción de ADN con material cotidiano: desarrollo de una estrategia interdisciplinar a partir de sus fundamentos científicos. Educación Química, 30(1), 58–69. https://doi.org/10.22201/FQ.18708404E.2019.1.65732

Suazo, T., Miranda, S., Rivers, E., Lacayo, M., & Tenorio, D. (2020). Evaluación de metodologías de extracción de ADN de plantas recalcitrantes. Revista Torreón Universitario, 9(24), 45–57. https://doi.org/10.5377/TORREON.V9I24.9723

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